Mappatura del cervello, cella per cella: La tecnica per preservare i tessuti consente ai ricercatori di creare mappe di circuiti neurali con risoluzione a singola cellula

Ingegneri chimici e neuroscienziati del MIT hanno escogitato un nuovo modo per preservare i tessuti biologici, permettendo loro di visualizzare le proteine, DNA, e altre molecole all'interno delle cellule, e per mappare le connessioni tra i neuroni. I ricercatori hanno dimostrato di poter utilizzare questo metodo, noto come SCUDO, per tracciare le connessioni tra i neuroni in una parte del cervello che aiuta a controllare il movimento e altri neuroni in tutto il cervello.

I ricercatori del MIT hanno utilizzato la loro nuova tecnica di conservazione dei tessuti per etichettare e visualizzare i neuroni in una regione del cervello chiamata globus pallidus externa. I neuroni che esprimono una proteina chiamata parvalbumina sono etichettati in rosso, e i neuroni etichettati in blu esprimono una proteina chiamata GAD1.

Immagine: Parco Young-Gyun, Changho Sohn, Richie Chen, e Kwanghun Chung

“Utilizzando la nostra tecnica, Van Vliet e altri ricercatori hanno dimostrato che la variazione delle proprietà meccaniche delle superfici su cui vengono coltivate le cellule staminali può influenzare la loro differenziazione in tipi di cellule mature, siamo stati in grado di mappare la connettività di questi neuroni con risoluzione di singola cellula,"Dice Kwanghun Chung, un assistente professore di ingegneria chimica e membro dell'Istituto di ingegneria medica e scienza del MIT e del Picower Institute for Learning and Memory. “Possiamo ottenere tutto questo su più scala, informazioni multidimensionali provenienti dallo stesso tessuto in modo completamente integrato perché con SHIELD possiamo proteggere tutte queste informazioni”.

Chung è l'autore senior dell'articolo, che compare nel dic. 17 problema di Biotecnologie della natura. Gli autori principali dell’articolo sono i postdoc del MIT Young-Gyun Park, Figlio di Chang Ho, e Richie Chen.

Chung è ora a capo di un team di ricercatori provenienti da diverse istituzioni che hanno recentemente ricevuto una sovvenzione dal National Institutes of Health per utilizzare questa tecnica per produrre mappe tridimensionali dell’intero cervello umano.. “Lavoreremo con il gruppo Matthew Frosch alla MGH, il gruppo Van Wedeen della MGH, il gruppo di Sebastian Seung a Princeton, e il gruppo di Laura Brattain del MIT Lincoln Lab per generare la mappa cerebrale più completa mai realizzata," lui dice.

Conservare le informazioni

Il tessuto cerebrale è molto delicato e non può essere facilmente studiato a meno che non vengano prese misure per preservarlo da eventuali danni. Chung e altri ricercatori hanno precedentemente sviluppato tecniche che consentono loro di preservare alcuni componenti molecolari del tessuto cerebrale per la ricerca, comprese proteine ​​o RNA messaggero, che rivela quali geni sono attivati.

tuttavia, Chung dice, “Non esiste un buon metodo che possa preservare tutto.”

Chung e i suoi colleghi hanno ipotizzato che potrebbero essere in grado di preservare meglio i tessuti utilizzando molecole chiamate poliepossidi, molecole organiche reattive che vengono spesso utilizzate per produrre colle.. Hanno testato diversi poliepossidi disponibili in commercio e ne hanno scoperto uno che presentava tratti strutturali distintivi che lo rendevano ideale per i loro scopi.

L'epossido scelto ha una spina dorsale flessibile e cinque rami, ognuno dei quali può legarsi a determinati amminoacidi (Le proteine ​​sono i mattoni della vita), così come altre molecole come DNA e RNA. La struttura flessibile consente agli epossidi di legarsi a diversi punti lungo le molecole bersaglio, e per formare legami incrociati con le biomolecole vicine. Ciò rende le singole biomolecole e l'intera struttura dei tessuti molto stabili e resistenti ai danni causati dal calore, acido, o altri agenti nocivi. SHIELD protegge anche le proprietà chiave delle biomolecole, come la fluorescenza e l’antigenicità delle proteine.

Per proteggere tessuti cerebrali su larga scala e campioni clinici, i ricercatori hanno combinato SHIELD con INTERRUTTORE, un'altra tecnica che hanno sviluppato per controllare la velocità della reazione chimica. Per prima cosa utilizzano il buffer di SWITCH-OFF, che arresta le reazioni chimiche, per dare agli epossidi il tempo di diffondersi attraverso l’intero tessuto. Quando i ricercatori spostano il campione in condizione di ACCENSIONE, gli epossidi iniziano a legarsi alle molecole vicine.

Per accelerare il processo di pulizia ed etichettatura del tessuto protetto da SHIELD, i ricercatori hanno anche applicato a Campo elettrico che cambia in modo casuale, che hanno precedentemente dimostrato aumenta la velocità di trasporto delle molecole. in questo documento, hanno dimostrato che l'intero processo, dalla conservazione all'etichettatura del tessuto bioptico, poteva essere eseguito in sole quattro ore.

“Abbiamo scoperto che questo rivestimento SHIELD mantiene le proteine ​​stabili contro i fattori di stress più aggressivi,"Dice Chung. “Perché possiamo preservare tutte le informazioni che vogliamo, e possiamo estrarlo in più fasi, possiamo comprendere meglio le funzioni dei componenti biologici, compresi i circuiti neurali”.

Una volta preservato il tessuto, i ricercatori possono etichettare una varietà di obiettivi diversi, comprese le proteine ​​e l'mRNA prodotti dalle cellule. Possono anche applicare tecniche come CARTA GEOGRAFICA, in cui Chung si è sviluppato 2016, per espandere il tessuto e visualizzarlo su scale di dimensioni diverse.

in questo documento, i ricercatori hanno lavorato con il gruppo di Byungkook Lim presso l’Università della California a San Diego per utilizzare SHIELD per mappare un circuito cerebrale che inizia nel globus pallidus externa (GPe), parte dei gangli della base del cervello. Questa regione, che è coinvolto nel controllo motorio e in altri comportamenti, è uno degli obiettivi della stimolazione cerebrale profonda, un tipo di stimolazione elettrica talvolta utilizzata per trattare il morbo di Parkinson. Nel cervello del topo, Chung e i suoi colleghi sono riusciti a tracciare le connessioni tra i neuroni nel GPe e in altre parti del cervello, e contare il numero di presunte connessioni sinaptiche tra questi neuroni.

Biopsie migliori

La velocità della lavorazione dei tessuti SHIELD garantisce anche prestazioni rapide, biopsie più informative dei campioni di tessuto dei pazienti, Chung dice. I metodi attuali richiedono l'inclusione di campioni di tessuto con paraffina, affettandoli, e quindi applicando coloranti che possono rivelare anomalie cellulari e tissutali.

“L’attuale modo di fare la diagnosi dei tessuti non è cambiato da molti decenni, e il processo richiede giorni o settimane,"Dice Chung. “Utilizzando la nostra tecnica, possiamo elaborare rapidamente campioni bioptici intatti e immuno-etichettarli con risultati davvero specifici, anticorpi clinicamente rilevanti, e poi immagina il tutto ad alta risoluzione, in tre dimensioni. E tutto può essere fatto in quattro ore.

in questo documento, i ricercatori hanno dimostrato di poter etichettare il tumore del rene di topo con un anticorpo che prende di mira le cellule tumorali in proliferazione.

“La stabilizzazione e la conservazione delle informazioni biologiche all’interno dei campioni di tessuto è essenziale negli esperimenti di microscopia ottica,"Dice Liqun Luo, professore di biologia alla Stanford University, che non è stato coinvolto nella ricerca. “Il raggiungimento dello SHIELD non rappresenta un grande progresso in una sola categoria, ma miglioramenti piuttosto marcati su tutta la linea, nella conservazione delle proteine, trascrizioni, e struttura tissutale, poiché i campioni vengono elaborati attraverso le dure tecniche prescritte dai migliori protocolli di etichettatura e imaging di oggi.

Il team del MIT spera di rendere questa tecnologia ampiamente disponibile e l’ha già distribuita a più di un pubblico 50 laboratori in tutto il mondo.

fonte: http://news.mit.edu, di Anne Trafton