In kaart brengen van de hersenen, cel voor cel: Techniek voor het behoud van het weefsel stelt onderzoekers in staat om kaarten van neurale circuits met single-cell resolutie creëren

MIT chemische ingenieurs en neurowetenschappers hebben een nieuwe manier om biologisch weefsel te behouden bedacht, waardoor ze eiwitten te visualiseren, DNA, en andere moleculen in cellen, en de verbindingen tussen neuronen kaart. De onderzoekers toonden aan dat ze deze methode kunnen gebruiken, bekend als SHIELD, om de verbindingen tussen neuronen te sporen in een deel van de hersenen dat besturingsbeweging en andere neuronen helpt gehele hersenen.

MIT onderzoekers gebruikten hun nieuw weefsel behoud techniek om te labelen en imago neuronen in de hersenen regio genaamd de globus pallidus externa. Neuronen dat een eiwit genaamd parvalbumin uitdrukken worden gelabeld in het rood, en neuronen blauw gemarkeerde brengen een eiwit genaamd GAD1.

Beeld: Young-Gyun Park, Changho Sohn, Ritchie Chen, en Kwanghun Chung

“Met behulp van onze techniek, Voor de eerste keer, we waren in staat om de connectiviteit van deze neuronen in kaart op single-cell resolutie,"Chung zegt Kwanghun, een assistent professor in de chemische technologie en een lid van het MIT Institute for Medical Engineering en Wetenschap en Picower Institute for Learning and Memory. “We kunnen dit alles multiscale krijgen, multidimensionale informatie uit hetzelfde weefsel in een volledig geïntegreerde manier, want met SHIELD kunnen we al deze informatie te beschermen.”

Chung is de senior auteur van het papier, die verschijnt in het december. 17 probleem van Nature Biotechnology. Het papier van de leidende auteurs zijn MIT postdocs Young-Gyun Park, Chang Ho Sohn, en Ritchie Chen.

Chung is nu leiding aan een team van onderzoekers uit verschillende instellingen die onlangs een National Institutes of Health verlenen om deze techniek te gebruiken om driedimensionale kaarten van de gehele menselijke hersenen produceren. “We zullen werken met de Matthew Frosch groep op MGH, Van Wedeen groep op MGH, de Sebastian Seung groep op Princeton, en de Laura Brattain groep aan het MIT Lincoln Lab nog de meest uitgebreide hersenen kaart te genereren," hij zegt.

Behoud van informatie

Hersenweefsel is zeer delicaat en kunnen niet gemakkelijk worden onderzocht, tenzij stappen worden ondernomen om het weefsel tegen beschadiging te behouden. Chung en andere onderzoekers hebben eerder ontwikkelde technieken die hen in staat stellen om bepaalde moleculaire componenten van hersenweefsel voor onderzoek te behouden, waaronder eiwitten of boodschapper RNA, waaruit blijkt welke genen aangezet.

Echter, Chung zegt, “Er is geen goede methode die alles kan behouden.”

Chung en zijn collega's de hypothese dat ze misschien in staat zijn om weefsel beter te bewaren met behulp van moleculen genaamd polyepoxiden - reactieve organische moleculen die vaak worden gebruikt om lijmen produceren. Ze testten verschillende commercieel verkrijgbare polyepoxiden en ontdekte men dat het onderscheidend structurele kenmerken dat maakte het bij uitstek geschikt voor hun doeleinden gehad.

Het epoxide ze kozen heeft een flexibele ruggengraat en vijf vestigingen, die elk aan bepaalde aminozuren kunnen binden (de bouwstenen van eiwitten), evenals andere moleculen zoals DNA en RNA. De flexibele ruggengraat zorgt ervoor dat de epoxiden zich kunnen binden aan verschillende plekken langs de doelmoleculen, en om verknopingen te vormen met nabijgelegen biomoleculen. Dit maakt individuele biomoleculen en de gehele weefselstructuur zeer stabiel en bestand tegen schade door hitte, zuur, of andere schadelijke middelen. SHIELD beschermt ook de belangrijkste eigenschappen van biomoleculen, zoals eiwitfluorescentie en antigeniciteit.

Om grootschalige hersenweefsels en klinische monsters te beschermen, de onderzoekers combineerden SHIELD met SCHAKELAAR, een andere techniek die ze hebben ontwikkeld om de chemische reactiesnelheid te regelen. Ze gebruiken eerst de SWITCH-OFF-buffer, die chemische reacties stopt, om de epoxiden de tijd te geven om door het hele weefsel te diffunderen. Wanneer de onderzoekers het monster in de SWITCH-ON-toestand brengen, de epoxiden beginnen te binden aan nabijgelegen moleculen.

Om het proces van opruimen en labelen van met SHIELD beschermd weefsel te versnellen, de onderzoekers pasten ook een willekeurig wisselend elektrisch veld, waaruit zij eerder aangetoond de transportsnelheid van de moleculen toeneemt. In deze krant, toonden ze aan dat het hele proces van het behoud van de etikettering van biopsie weefsel zou kunnen worden uitgevoerd in slechts vier uur.

“Wij vinden dat dit SHIELD coating houdt eiwitten stabiel tegen barre stressoren,”Chung zegt. “Omdat we alle informatie die we willen kunnen behouden, en we kunnen het uit te pakken op meerdere stadia, kunnen we beter inzicht in de functies van de biologische componenten, met inbegrip van neurale circuits.”

Zodra het weefsel is geconserveerd, de onderzoekers kunnen verschillende doelen labelen, inclusief eiwitten en mRNA geproduceerd door de cellen. Ze kunnen ook technieken toepassen zoals: KAART, waarin Chung zich ontwikkelde 2016, om het weefsel uit te breiden en het op verschillende schalen in beeld te brengen.

In deze krant, de onderzoekers werkten samen met de groep van Byungkook Lim aan de Universiteit van Californië in San Diego om SHIELD te gebruiken om een ​​hersencircuit in kaart te brengen dat begint in de globus pallidus externa (GPe), deel van de basale ganglia van de hersenen. Deze regio, die betrokken is bij motorische controle en ander gedrag, is een van de doelen van diepe hersenstimulatie - een soort elektrische stimulatie die soms wordt gebruikt om de ziekte van Parkinson te behandelen. In het muizenbrein, Chung en zijn collega's waren in staat om de verbindingen tussen neuronen in de GPe en in andere delen van de hersenen te traceren, en om het aantal vermeende synaptische verbindingen tussen deze neuronen te tellen.

Betere biopsieën

De snelheid van SHIELD-weefselverwerking betekent dat het ook veelbelovend is voor snelle prestaties, informatiever biopten van patiënten weefselmonsters, Chung zegt. De huidige methoden vereisen het inbedden van weefselmonsters met paraffine, het snijden van hen, en vervolgens aanbrengen vlekken die cellen en weefsels afwijkingen kan onthullen.

“De huidige manier van doen weefsel diagnose is niet veranderd in vele decennia, en het proces duurt dagen of weken,”Chung zegt. “Met behulp van onze techniek, kunnen we snel verwerken intact biopsie monsters en immuno-label ze met heel specifieke, klinisch relevante antilichamen, in beeld om vervolgens de hele zaak met een hoge resolutie, in drie dimensies. En alles kan in vier uur.”

In deze krant, de onderzoekers toonden aan dat ze muizenniertumor konden labelen met een antilichaam dat zich richt op prolifererende kankercellen.

"De stabilisatie en bewaring van biologische informatie in weefselmonsters is essentieel in experimenten voor optische microscopie," zegt Liqun Luo, een professor in de biologie aan de Stanford University, die niet betrokken was bij het onderzoek. “De prestatie van SHIELD is geen grote vooruitgang in slechts één categorie, maar eerder duidelijke verbeteringen over de hele linie, bij het bewaren van eiwitten, transcripties, en weefselstructuur, omdat monsters worden verwerkt met behulp van de harde technieken die worden voorgeschreven door de beste etiketterings- en beeldvormingsprotocollen van vandaag."

De MIT-team hoopt deze technologie op grote schaal beschikbaar te maken en heeft al uitgedeeld aan meer dan 50 laboratoria over de hele wereld.

Bron: http://news.mit.edu, door Anne Trafton