Kartierung des Gehirns, Zelle für Zelle: Eine Technik zur Gewebekonservierung ermöglicht es Forschern, Karten neuronaler Schaltkreise mit Einzelzellauflösung zu erstellen

Chemieingenieure und Neurowissenschaftler des MIT haben einen neuen Weg entwickelt, um biologisches Gewebe zu konservieren, So können sie Proteine ​​sichtbar machen, DNA, und andere Moleküle in Zellen, und um die Verbindungen zwischen Neuronen abzubilden. Die Forscher zeigten, dass sie diese Methode nutzen könnten, bekannt als SHIELD, um die Verbindungen zwischen Neuronen in einem Teil des Gehirns zu verfolgen, der dabei hilft, Bewegungen und andere Neuronen im gesamten Gehirn zu steuern.

MIT-Forscher nutzten ihre neue Gewebekonservierungstechnik, um Neuronen in einer Gehirnregion namens Globus pallidus externa zu markieren und abzubilden. Neuronen, die ein Protein namens Parvalbumin exprimieren, sind rot markiert, und blau markierte Neuronen exprimieren ein Protein namens GAD1.

Bild: Young-Gyun-Park, Changho Sohn, Ritchie Chen, und Kwanghun Chung

„Mit unserer Technik, zum ersten Mal, Wir konnten die Konnektivität dieser Neuronen mit Einzelzellauflösung abbilden,“, sagt Kwanghun Chung, ein Assistent Professor für Chemieingenieurwesen und Mitglied des MIT-Institut für Medizintechnik und Wissenschaft und PICOWER Institut für Lernen und Gedächtnis. „Wir können alle diese mehreren Maßstäben erhalten, multidimensionale Informationen aus demselben Gewebe in einer vollständig integrierten Art und Weise, weil mit SHIELD können wir alle diese Informationen schützen.“

Chung ist der leitende Autor des Papiers, die erscheint im Dezember. 17 Problem von Nature Biotechnology. Das Papier der führenden Autoren sind MIT Postdocs Young-Gyun Park, Chang Ho Sohn, und Ritchie Chen.

Chung ist jetzt ein Team von Forschern aus mehreren Institutionen führt, die vor kurzem eine National Institutes of Health gewähren, diese Technik zu verwenden, dreidimensionale Karten des gesamten menschlichen Gehirns zu erzeugen. „Wir werden bei MGH mit der Matthew Frosch-Gruppe arbeiten, Van der Wedeen Gruppe an MGH, die Sebastian Seung-Gruppe an der Princeton, und die Laura Brattain Gruppe am MIT Lincoln Lab die umfassendste Gehirn Karte erzeugen noch," er sagt.

Die Erhaltung Informationen

Gehirngewebe ist sehr empfindlich und kann nicht einfach untersucht werden, es sei denn, es werden Maßnahmen ergriffen, um das Gewebe vor Schäden zu bewahren. Chung und andere Forscher haben bereits Techniken entwickelt, die es ihnen ermöglichen, bestimmte molekulare Bestandteile des Gehirngewebes für Forschungszwecke zu konservieren, einschließlich Proteinen oder Boten-RNA, was zeigt, welche Gene aktiviert sind.

jedoch, Chung sagt, „Es gibt keine gute Methode, die alles bewahren kann.“

Chung und seine Kollegen stellten die Hypothese auf, dass sie Gewebe mithilfe von Molekülen namens Polyepoxiden – reaktiven organischen Molekülen, die häufig zur Herstellung von Klebstoffen verwendet werden – möglicherweise besser konservieren könnten. Sie testeten mehrere im Handel erhältliche Polyepoxide und entdeckten eines, das besondere Strukturmerkmale aufwies, die es ideal für ihre Zwecke geeignet machten.

Das von ihnen gewählte Epoxid verfügt über ein flexibles Rückgrat und fünf Verzweigungen, Jedes davon kann an bestimmte Aminosäuren binden (die Bausteine ​​der Proteine), sowie andere Moleküle wie DNA und RNA. Das flexible Rückgrat ermöglicht es den Epoxiden, an mehreren Stellen entlang der Zielmoleküle zu binden, und Vernetzungen mit benachbarten Biomolekülen zu bilden. Dadurch werden einzelne Biomoleküle und die gesamte Gewebestruktur sehr stabil und resistent gegen Hitzeschäden, Säure, oder andere schädliche Stoffe. SHIELD schützt auch wichtige Eigenschaften von Biomolekülen, wie Proteinfluoreszenz und Antigenität.

Zum Schutz von großflächigem Gehirngewebe und klinischen Proben, Die Forscher kombinierten SHIELD mit SCHALTEN, eine weitere Technik, die sie entwickelten, um die Geschwindigkeit chemischer Reaktionen zu steuern. Sie verwenden zunächst den SWITCH-OFF-Puffer, was chemische Reaktionen stoppt, um den Epoxiden Zeit zu geben, durch das gesamte Gewebe zu diffundieren. Wenn die Forscher die Probe in den EINSCHALTUNG-Zustand versetzen, Die Epoxide beginnen, sich an benachbarte Moleküle zu binden.

Um den Reinigungs- und Kennzeichnungsprozess von SHIELD-geschütztem Gewebe zu beschleunigen, Die Forscher verwendeten auch a sich zufällig änderndes elektrisches Feld, Sie haben zuvor gezeigt, dass sich die Transportgeschwindigkeit der Moleküle erhöht. In diesem Papier, Sie zeigten, dass der gesamte Prozess von der Konservierung bis zur Markierung des Biopsiegewebes in nur vier Stunden durchgeführt werden konnte.

„Wir haben herausgefunden, dass diese SHIELD-Beschichtung Proteine ​​gegenüber harten Stressfaktoren stabil hält,“, sagt Chung. „Weil wir alle Informationen bewahren können, die wir wollen, und wir können es in mehreren Schritten extrahieren, Wir können die Funktionen biologischer Komponenten besser verstehen, einschließlich neuronaler Schaltkreise.“

Sobald das Gewebe konserviert, Die Forscher können eine Vielzahl von verschiedenen Zielen beschriften, einschließlich Proteine ​​und mRNA von den Zellen produziert. Sie können auch Techniken anwenden, wie zum Beispiel KARTE, die Chung entwickelt in 2016, das Gewebe und Bild, um es in unterschiedlichen Größenskalen zu erweitern.

In diesem Papier, Die Forscher arbeiteten mit Byungkook Lims Gruppe an der University of California in San Diego SHIELD zu verwenden, um ein Gehirn Schaltung zur Karte, die in der Pallidum externa beginnt (GPe), Teil der Basalganglien des Gehirns. Diese Region, das an der motorischen Kontrolle und anderen Verhaltensweisen beteiligt ist, ist eines der Ziele der tiefen Hirnstimulation – einer Art elektrischer Stimulation, die manchmal zur Behandlung der Parkinson-Krankheit eingesetzt wird. Im Gehirn der Maus, Chung und seine Kollegen konnten die Verbindungen zwischen Neuronen im GPe und in anderen Teilen des Gehirns verfolgen, und um die Anzahl der mutmaßlichen synaptischen Verbindungen zwischen diesen Neuronen zu zählen.

Bessere Biopsien

Die Geschwindigkeit der SHIELD-Gewebeverarbeitung verspricht auch eine schnelle Leistung, aussagekräftigere Biopsien von Patientengewebeproben, Chung sagt. Aktuelle Methoden erfordern die Einbettung von Gewebeproben mit Paraffin, sie in Scheiben schneiden, und anschließendes Auftragen von Färbemitteln, die Zell- und Gewebeanomalien sichtbar machen können.

„Die derzeitige Art der Gewebediagnose hat sich seit vielen Jahrzehnten nicht verändert, und der Prozess dauert Tage oder Wochen,“, sagt Chung. „Mit unserer Technik, Wir können intakte Biopsieproben schnell verarbeiten und sie mit einer wirklich spezifischen Immunmarkierung versehen, klinisch relevante Antikörper, und dann das Ganze in hoher Auflösung abbilden, in drei Dimensionen. Und alles ist in vier Stunden erledigt.“

In diesem Papier, Die Forscher zeigten, dass sie Mäusenierentumoren mit einem Antikörper markieren konnten, der auf proliferierende Krebszellen abzielt.

„Die Stabilisierung und Erhaltung biologischer Informationen in Gewebeproben ist bei Experimenten zur optischen Mikroskopie von entscheidender Bedeutung,“, sagt Liqun Luo, Professor für Biologie an der Stanford University, die nicht in der Forschung beteiligt. „Der Erfolg von SHIELD ist kein großer Fortschritt in nur einer Kategorie, sondern deutliche Verbesserungen auf ganzer Linie, bei der Konservierung von Proteinen, Abschriften, und Gewebestruktur, während die Proben mit den harten Techniken verarbeitet werden, die in den besten Etikettierungs- und Bildgebungsprotokollen von heute vorgeschrieben sind.“

Das MIT-Team hofft, diese Technologie allgemein verfügbar zu machen und hat sie bereits an mehr als verteilt 50 Labore auf der ganzen Welt.

Quelle: http://news.mit.edu, von Anne Trafton